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Percoll 細胞分離液
 產品貨號: PE170891
 產品名稱: Percoll 細胞分離液
 產品價格/規格: 100ml 600元
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 更新時間: 2019-10-18
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  • Percoll不連續密度梯度沉淀法分離純化淋巴細胞和淋巴母細胞

    (一) 原理

    Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20mosmkg HO), 粘度也很小,可形成高達1.3gml密度,采用預先形成的密度梯度時可在低離心力(2001000g)于數分至數十分鐘內達到滿意的細胞分離結果。由于Percoll擴散常數低,所形成的梯度十分穩定。此外,Percoll不穿透生物膜,對細胞無毒害,因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒,還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。

    )操作方法及注意事項
    1.不同濃度(密度)Percoll溶液的制備: 先用9Percoll18.5 NaCl1.5MPBS混合達到生理性滲透壓,然后用生理溶液(0.85 NaCl0.15M PBS)稀釋到所需濃度。
    Percoll濃度() 70 60 50 40 30 20
    比重gml   1.090     1.077     1.067     1.056     1.043       1.031

    2.不連續密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤,除去多余血清,這種預處理可使逐層疊加的Percoll液平穩沿管壁流下,使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置,有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時,可將Percoll液放入注射器中,小針頭斜面緊貼管壁,任其自然慢慢流下。
        3.
    裝樣:樣品體積和細胞濃度根據不同細胞而異,一般加樣體積不宜過大,細胞濃度也不可過高,否則會影響細胞的分離和回收。
        4.
    離心:一般采用離心力為400g,時間2025min。由于多層Percoll之間密度差別不大,因此離心機加速、降速時要慢,要平穩。
        5.
    取樣:當所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時,可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細胞;有時大部分細胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細胞經2次洗滌后可供培養或檢測用。
    ()分離純化細胞舉例
    1.富含NK活性大顆粒淋巴細胞(LGL)的純化:按順序由下向上逐層加50%、47.5%、45%、42.5%和40%五種不同密度的Percoll,如用10ml試管(或塑料管)分離,每層Percoll1.21.5ml,初步從外周血中分離的PBMC細胞1×108懸于1ml培基中,按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細胞位于42.5%與45Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。
        2.
    純化淋巴母細胞和除去死細胞:分別疊加50%和30Percoll液。收取經PHA(或其它抗原、有絲分裂原)刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC(如腎綜合征出血熱患者),按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細胞為小淋巴細胞;兩層Percoll之間為淋巴母細胞,純度和回收率在80%以上,位于30Percoll表面是死細胞。收獲淋巴母細胞可進行表型、結構以及功能的研究。

    (四) 人不同血細胞的漂浮密度
    表   人不同血細胞的漂浮密度
    ──────────────┬──────────────────
    細 胞   漂浮密度    │ 細 胞       漂浮密度
    ──────────────┼──────────────────
    紅細胞 1.09-1.11 │淋巴細胞 1.052-1.077
    粒細胞   B淋巴細胞 1.062-1.075
    嗜酸性 1.09-1.095   T淋巴細胞 1.065-1.077
    嗜中性 1.080-1.085 │ 淋巴母細胞 1.065-1.077
    單核細胞 1.050-1.066 │自然殺傷細胞 1.050-1.070
    血小板 1.030-1.060
    ──────────────┴──────────────────

    percoll連續梯度怎么配制?比如15%---75%的percoll連續梯度?
    答:根據你需要的具體密度梯度決定的,根據要分離的不同細胞種類,數量等等,也有用原液配的。也有用80%配的,不一定的。另外,percoll本身是低滲透壓的,要用高滲透壓溶液配成生理等滲透壓溶液,然后使用,不然,細胞容易破裂。一般是先用9份Percoll與1份8.5% NaCl或1.5MPBS混合達到生理性滲透壓,然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15MPBS)稀釋到所需濃度。即取Percoll原液與10倍濃縮的PBS以9:1的比例混合,此時溶液 為100% Percoll,比重是1.127,毫克分子滲透壓濃度為290mOsmol/kg
    Percoll濃度(%)  70     60      50      40      30       20
    比重g/ml      1.090  1.077    1.067   1.056   1.043    1.031

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